高通量連接探針擴(kuò)增技術(shù)在第八屆國(guó)際先心病高峰論壇上閃亮登場(chǎng)

發(fā)稿時(shí)間：2017-11-15來(lái)源：天昊診斷

         2017年10月10-12日，國(guó)際先天性心臟病高峰論壇暨中國(guó)胎兒心臟出生缺陷一體化診療協(xié)作組2017年年會(huì)在上海盛大召開(kāi)。

         本次會(huì)議對(duì)先天性心臟病的診治前沿、外科術(shù)式及遠(yuǎn)期療效、內(nèi)外科綜合診療以及圍術(shù)期管理等方面進(jìn)行深入的探討。會(huì)議邀請(qǐng)國(guó)際小兒先天性心臟病外科協(xié)會(huì)主席、美國(guó)國(guó)立兒童醫(yī)學(xué)中心心臟中心主任Richard Jonas擔(dān)任會(huì)議的共同執(zhí)行主席，同時(shí)邀請(qǐng)包括中國(guó)、日本、韓國(guó)、歐美、澳大利亞在內(nèi)的國(guó)際嘉賓同行進(jìn)行專題講座和現(xiàn)場(chǎng)交流，并一起分享交流今年國(guó)內(nèi)外兒童心血管學(xué)科的最新進(jìn)展及共同的機(jī)遇和挑戰(zhàn)。

         本次會(huì)議上，天昊基因科技（蘇州）有限公司的CEO姜正文博士帶來(lái)的《高通量連接探針擴(kuò)增技術(shù)在胎兒心臟出生缺陷遺傳診斷中的應(yīng)用》 精彩學(xué)術(shù)報(bào)告在會(huì)場(chǎng)上引起強(qiáng)烈反響。

         復(fù)旦大學(xué)遺傳學(xué)和遺傳工程系本科生及碩士生，于2008年3月獲美國(guó)辛辛那提大學(xué)環(huán)境基因組學(xué)專業(yè)博士，是蘇州工業(yè)園區(qū)第五屆科技領(lǐng)軍人才、2014年江蘇省高層次創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)人才獲得者，是復(fù)旦大學(xué)副校長(zhǎng)金力院士的碩士及博士研究生，先后工作于國(guó)家人類基因組南方研究中心以及中科院計(jì)算生物學(xué)研究所，發(fā)表二十多篇SCI論文，是公司所有技術(shù)平臺(tái)的主要開(kāi)發(fā)者以及所有創(chuàng)新技術(shù)的發(fā)明者。

         高通量基因拷貝數(shù)檢測(cè)技術(shù)（HLPA）是天昊診斷自主創(chuàng)新的專利技術(shù)，該技術(shù)是基于熒光毛細(xì)管電泳平臺(tái)，設(shè)計(jì)靶向探針進(jìn)行拷貝數(shù)計(jì)算，通過(guò)與參照樣本的拷貝數(shù)對(duì)比，確定靶向染色體片段拷貝數(shù)是否正常，以此達(dá)到檢測(cè)拷貝數(shù)的目的。



1. 先心病患兒的高出生率：

         心臟缺陷是最普遍的出生缺陷。在2015年，全國(guó)的心臟缺陷患者是4890萬(wàn)，根據(jù)診斷方式的不同，心臟缺陷患兒的出生率大約是每1000個(gè)活產(chǎn)嬰兒就有4-75個(gè)患兒。

         在中國(guó)，先天性心臟病每年影響著18萬(wàn)-22萬(wàn)的孩子。

2. 導(dǎo)致先天性心臟病的原因：

         非遺傳性的：
         環(huán)境致畸
         母源性因素
         感染因素

         遺傳性的：
         染色體非整倍體
         染色體微缺失微重復(fù)
         單基因疾病

3. 根據(jù)先心病患兒發(fā)病部位的統(tǒng)計(jì)：

         心臟缺陷的位置通常在患者的嬰兒期就能被確認(rèn)，流行的程度是基于CONCOR數(shù)據(jù)庫(kù)來(lái)估計(jì)的。下面的數(shù)據(jù)是每百萬(wàn)活產(chǎn)嬰兒中根據(jù)心臟缺陷的位置來(lái)統(tǒng)計(jì)的患兒的數(shù)量。

4. 由染色體結(jié)構(gòu)異常導(dǎo)致的綜合征型先心病

         染色體結(jié)構(gòu)異?？蓪?dǎo)致綜合征型先心病的發(fā)生，最為常見(jiàn)的是22q11的缺失，缺失部位發(fā)生在22q11.2上，大多數(shù)22q11.2缺失綜合征是每個(gè)細(xì)胞的一條22號(hào)染色體上有一個(gè)3Mb堿基對(duì)的缺失，這段缺失大約涉及30-40個(gè)基因。其中位于22q11.2上的TBX1可能導(dǎo)致22q11.2微缺失綜合征的大多數(shù)臨床特征。最主要的臨床癥狀是先天性心臟病（80-100%的患者），尤其是先天性心臟錐干畸形（法洛四聯(lián)癥、主動(dòng)脈弓中斷、室間隔缺損及動(dòng)脈干），其他的癥狀包括上顎畸形（69%）、學(xué)習(xí)障礙（70-90%）、免疫缺陷、低鈣血癥、腎臟異常、聽(tīng)力喪失和喉氣管食管異常等。22q11.2微缺失綜合征大多都是新發(fā)突變導(dǎo)致的（約占90%），約10%患者的缺失遺傳于父母。除了22q11缺失外，其他包括Williams-Beuren、Cri-Du-Chat、Cat-Eye、Jacobsen等綜合征都能引起先心病。

5. 與拷貝數(shù)變異相關(guān)的復(fù)發(fā)性非綜合征型先心病

         大多數(shù)的非綜合征型先心病是由多基因控制的，即：絕大部分非綜合征型先心病是由于多個(gè)基因座上存在有易感基因并共同相互作用，有時(shí)還需要一定的環(huán)境因素參與而導(dǎo)致的。如1q21.1這個(gè)位置上的缺失會(huì)造成法洛氏四聯(lián)癥、主動(dòng)脈瓣狹窄、心室中隔缺損等。而在這個(gè)基因座上能引起先心病的基因卻有好多個(gè)。

6. 由單基因遺傳病引起的先心病

         通常這種類型的先心病患兒父母一方也是患有先心病的，或是父母雙方?jīng)]有先心病但都同時(shí)帶有同一先心病基因的突變，當(dāng)患兒同時(shí)攜帶有父母這對(duì)等位基因的突變時(shí)就有可能致病。

7. 拷貝數(shù)異常的篩查對(duì)于鑒別遺傳因素引起的先心病患者的重要性

         在用CMA（染色體微陣列）技術(shù)對(duì)先心病患者檢測(cè)后，對(duì)遺傳因素引起的先心病進(jìn)行統(tǒng)計(jì)：

         ? 對(duì)514名先心病患者用CMA進(jìn)行檢測(cè)，總體檢出率為12.8 (致病的拷貝數(shù)變異）-18.5% （致病的和可能致病的拷貝數(shù)變異）

         ? 綜合征型先心病的診斷率為14.1-20.6%（不包括染色體非整倍體的病例）

         ? 單獨(dú)的先心病的診斷率為4.3-9.3%

        研究發(fā)現(xiàn)，由于患者染色體拷貝數(shù)變異引起的先心病具有很大的一部分比例，而染色體拷貝數(shù)變異又是引起染色體微缺失/微重復(fù)綜合癥的主要原因。因此，對(duì)先心病患者進(jìn)行分類就顯得尤為重要。

8. 幾種拷貝數(shù)變異檢測(cè)方法進(jìn)行比較：

         ? CGH（比較基因組雜交）：整個(gè)基因組進(jìn)行檢測(cè)，分辨率低（0.5-1Mb）

         ? CMA (染色體微陣列）：整個(gè)基因組進(jìn)行檢測(cè)，分辨率高（~100Kb）

         ? NGS （二代測(cè)序）：整個(gè)基因組進(jìn)行檢測(cè)，分辨率依賴于檢測(cè)的深度（100Kb-5Mb）

         ? 目標(biāo)拷貝數(shù)變異檢測(cè)(MLPA, CNVplex): 對(duì)目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行檢測(cè)，高分辨率（<1Kb)

          目標(biāo)拷貝數(shù)變異檢測(cè)無(wú)論在分辨率、檢測(cè)成本還是實(shí)驗(yàn)操作的難易程度上都具有明顯優(yōu)勢(shì)。

9. 新一代MLPA, CNVplex?高通量連接探針擴(kuò)增技術(shù)（HLPA)

          采用連接酶高特異性連接反應(yīng)對(duì)目的區(qū)域進(jìn)行雜交、連接，通過(guò)專利技術(shù)在連接探針末段引入不同長(zhǎng)度的標(biāo)簽序列獲得長(zhǎng)度各異的目的探針連接產(chǎn)物，利用熒光標(biāo)記的通用引物對(duì)連接產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過(guò)熒光毛細(xì)管電泳對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳分離檢測(cè)，最后通過(guò)對(duì)電泳圖譜的分析獲取各個(gè)位點(diǎn)的峰高，進(jìn)而對(duì)樣品目的區(qū)域的拷貝數(shù)進(jìn)行分析。

          高通量：雙連接后進(jìn)行多重?zé)晒釶CR
          高檢出率：一個(gè)反應(yīng)超過(guò)200個(gè)探針
          高準(zhǔn)確性：小探針的高效連接，變異系數(shù)低（CV<10%)

10. 采用天昊基因自主專利CNVplex?技術(shù)對(duì)273例先心病患者進(jìn)行檢測(cè)，遺傳學(xué)病因的檢出率為~10%，這與文獻(xiàn)報(bào)道的先心病患者可診斷的遺傳學(xué)病因的概率12.8%基本一致。

          根據(jù)姜博士在會(huì)場(chǎng)上分享的數(shù)據(jù)，先心病患者中約有10%的患者同時(shí)帶有染色體微缺失微重復(fù)（拷貝數(shù)異常），而部分微缺失/微重復(fù)是導(dǎo)致患兒死亡的病因。染色體微缺失/微重復(fù)的先心病患兒通常會(huì)有特殊面容及不同程度的先天畸形，他們的內(nèi)分泌代謝也會(huì)有異常（血鈣降低、甲狀旁腺素降低等）影響患兒生長(zhǎng)發(fā)育，患兒也容易出現(xiàn)免疫功能異常、精神運(yùn)動(dòng)發(fā)育遲緩、學(xué)習(xí)困難、智力障礙等情況。因此，染色體微缺失/微重復(fù)檢測(cè)對(duì)診斷和治療先心病具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

          1. 排查染色體是否存在異常，并明確異常來(lái)源，確定病因。

          2. 如果發(fā)現(xiàn)有微缺失患兒，該夫婦再次生育患病兒的風(fēng)險(xiǎn)增大，有利于為有計(jì)劃生育下一胎的家庭提供必要的醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)指導(dǎo)。

          3. 能使醫(yī)生及時(shí)給出治療方案，減緩病情，治療病癥，改善患兒生存質(zhì)量。

          4. 降低圍產(chǎn)兒病死率，降低出生缺陷率，提高人口素質(zhì)。



          本項(xiàng)檢測(cè)所采用的技術(shù)是在傳統(tǒng)的多重連接探針擴(kuò)增技術(shù)（MLPA）基礎(chǔ)上經(jīng)公司自主研發(fā)改進(jìn)后具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的CNVplex?高通量連接探針擴(kuò)增技術(shù)（HLPA），詳細(xì)技術(shù)原理說(shuō)明見(jiàn)附錄四。該檢測(cè)體系由8個(gè)CNVplex反應(yīng)組成，總共包含了1428對(duì)探針，覆蓋了200個(gè)核心區(qū)域以及核心區(qū)域兩側(cè)一定范圍區(qū)域、所有染色體著絲粒兩側(cè)和兩端染色體離末端約0Mb, 10Mb, 20Mb處區(qū)域、以及3個(gè)突變位點(diǎn)（RBM8A ：c.67+32G>C, c.-21delG; FGFR3：c.1138G>A），可對(duì)DECIPHER認(rèn)定的70個(gè)綜合征對(duì)應(yīng)區(qū)域缺失重復(fù)或點(diǎn)突變位點(diǎn)(見(jiàn)下圖)，ISCA數(shù)據(jù)庫(kù)中所有被至少4個(gè)先天系統(tǒng)性發(fā)育異常以及智力發(fā)育遲緩高風(fēng)險(xiǎn)CNV區(qū)段覆蓋的區(qū)域的缺失重復(fù)，以及所有染色體非整倍體及染色體末端缺失重復(fù)進(jìn)行檢測(cè)，預(yù)計(jì)對(duì)致病高風(fēng)險(xiǎn)的染色體微缺失微重復(fù)突變的檢出率為90%以上。


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